Сонолитография: акустическая печать микрочастицами


Автор: Dmytro_Kikot. Дети, воистину, удивительные создания. Они способны на непонятном для нас, взрослых, уровне воспринимать окружающий мир, превращая даже самые сложные и запутанные законы природы в веселую игру. Стоит показать ребенку, что нанесенный на камешек рисунок потом можно перепечатать с камня на бумагу, как все вокруг становится холстом для шедевра юного художника, от пола и стен, до комнатных растений и домашних питомцев (кто сказал, что нельзя поставить штамп на кота?).

За детской шалостью скрывается вполне взрослая техника печати, называемая литографией. За долгие годы существования данной техники она была преобразована в новые форматы с учетом новых технологий: ионно-лучевая, нанопечатная, рентгеновская, ультрафиолетовая и т.д. И вот ученые из университета Бата (город Бат, Великобритания) решили объединить литографию и акустические волны, что позволило им получить контроль над микрочастицами внутри жидкостей.

Как именно использовался звук в литографии, какие частицы подвергались воздействию, и что из этого вышло? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Одним из основных преимуществ акустофоретических (на базе звука) методов работы с частицами является возможность проводить манипуляции бесконтактно. Постоянные поля акустического давления, создаваемые одним или несколькими преобразователями, содержат регулярные распределения областей высокого давления (пучностей) и областей нулевого давления (узлов).

Пучность — участок стоячей волны, в котором колебания имеют наибольшую амплитуду.

Узел — участок волны, в котором амплитуда колебаний минимальна.

На положение частицы в пространстве влияют как свойства материала этой частицы, так и свойства окружающей среды, в которой она находится. Следовательно, манипуляции с акустическими свойствами среды можно получить контроль над положением частицы.

Ранее подобное уже было достигнуто. Было продемонстрировано манипулирование популяциями частиц размером от микрометра до миллиметра с помощью акустических сил для жидкостей: разделение и фильтрация загрязняющих веществ в гетерогенном растворе; изменение концентрации клеток в суспензии; сортировка частиц в микрофлюидных устройствах, а также пространственная организация частиц в одном, двух и трех измерениях.

Использование акустического моделирования имеет особое значение для биотехнологических приложений из-за бесконтактного характера взаимодействия с частицами, а также из-за относительно низких требований к мощности (в отличие от оптического пинцета) и отсутствия необходимости в химических или физических модификациях клеток (в отличие от магнитных методов).

Если какие-либо манипуляции осуществляются в воздушной среде, то обычно используются частоты в низком ультразвуковом диапазоне из-за быстро увеличивающегося затухания с увеличением частоты. В воздухе ультразвуковые устройства со стоячей волной в основном используются для бесконтейнерной обработки или анализа. В работе с аэрозолями также были определенные успехи, однако они были сопряжены с рядом ограничений.

Пример фигур Хладни, образующихся на поверхности вибрирующей пластины.

Так, например, создание рисунка твердыми частицами на вибрирующей пластине (фигуры Хладни) вдохновило на создание подобной методики, но уже в жидкостной среде. Однако в таком случае существовало ограничение в виде той самой вибрирующей пластины (т.е. в ее параметрах: геометрия, гибкость и т.д.).

В рассматриваемом нами сегодня труде ученые продемонстрировали метод сонолитографии, т.е. воздушного акустофоретического метода для создания узорчатых поверхностей из аэрозольных капель или твердых частиц.

Сонолитография использует ультразвуковые стоячие волны в воздухе для создания рисунка скоплений жидких капель или твердых частиц на подложке, когда они продвигаются через акустическое поле (1а). Массив стоячих волн генерировался путем расположения противоположных пар ультразвуковых преобразователей с частотой 40 кГц, что давало полуволновое расстояние в воздухе при комнатной температуре, равное 4.3 мм. В результате был создан восьмиугольный массив с четырьмя парами преобразователей, равномерно расположенных по периметру на расстоянии в 5λ (43 мм) друг от друга.

s1.pngИзображение №1

Каждая пара преобразователей создавала псевдо-одномерное поле стоячей волны. Увеличение количества пар преобразователей увеличивало сложность результирующего шаблона и позволяло генерировать несколько шаблонов в одном массиве посредством активации отдельных пар преобразователей.

Интерференция стоячих волн приводит к появлению усредненных по времени пространственно согласованных полей акустического давления с характерными картинами. Пространственное распределение узлов и пучностей позволяет манипулировать частицами/каплями и, следовательно, картиной, которую они формируют.

Ученые объясняют, что обычно частицы в режиме Рэлея (т.е. малые по сравнению с длиной волны) и материалы, которые являются относительно плотными по отношению к основной среде (например, капли воды в воздухе), подчиняются теории потенциалов Горькова и движутся к узлам акустического давления. Посему поле акустического давления было смоделировано на основе расположения ультразвуковых преобразователей (1b), которое соответствует расположению акустических узлов и пучностей, из чего следует вполне предсказуемый узор из частиц/капель.

В результате быстрое формирование узора (< 10 с), вызванное акустическим полем, было визуализировано с помощью воды и бумаги, которая меняет цвет с желтого на синий при воздействии водных растворов (слева на 1c и 1d). Также для визуализации использовался цветной песок (0.5…1 мм в диаметре; справа на 1d).

Популяция капель воды (⌀ = 1–5 мкм) была создана с помощью вибрирующей пьезоэлектрической сетки медицинского небулайзера. Для контроля над образованием более крупных капель использовался пьезоэлектрический генератор капель по запросу (DOD от droplet-on-demand) с соплами с внутренним диаметром 25 и 80 мкм. Таким образом можно было получать капли разных размеров.

Видеопрезентация разработки.

Изменение цвета впервые наблюдалось после ≈10 секунд воздействия поля, при этом узор становился полностью виден уже через 15 секунд (1с). Показатель времени напрямую зависит и от состояния окружающей среды: например, какой-либо поток воздуха может привести к удалению капель от поля.

Локализация пучности капель, производимых медицинским небулайзером, которые были на порядок меньше, чем DOD-капли, четко наблюдалось, когда оба метода образования капель использовались последовательно на одном и том же листе водочувствительной бумаги (1d). Расположение пучностей и узлов также подтверждалось с помощью графика нормализованной радиальной средней интенсивности пикселей в зависимости от расстояния от центра узорчатой области (1e).

Наблюдаемые различия между узловыми и пучными каплями указывает на то, что локализация является функцией размера частиц, а не свойств материала, поскольку в обоих методах использовалась вода. Пороговые размеры частиц, которые могут применяться в данном методе, были установлены теоретически и составляют порядка 26.6 мкм в диаметре.

s2.pngВосьмиугольная матрица, используемая для экспериментальной работы: а — цветной песок мигрировал в пучность поля акустического давления; b — распыленная вода, формирующая узор.

Стоит отметить, что частицы, которые обнаруживались в ходе практических опытов (диаметр от 5 до 25 мкм) по своим габаритам очень схожи с некоторыми клетками млекопитающих. Упоминание клеток живых организмов сделано не просто так, ибо в рамках биопроизводства методы бесконтактного манипулирования популяциями частиц/капель являются более «бережной» альтернативой классических методов, в ходе которых жесткие условия (например, высокая интенсивность лазерного излучения) могут отрицательно влиять на жизнеспособность клеток или даже денатурировать белки.

В результате практических опытов удалось нанести узор коллагена типа I на чашу Петри для создания пространственно определенных областей для клеточной адгезии (сцепления). Используя восьмиугольную матрицу, раствор коллагена I объемом 0.2 мг/мл наносился на 10-сантиметровую чашку Петри, изготовленную из полистирола для тканевых культур (TCP от tissue culture polystyrene). Если поверхность не обрабатывать, то клетки будут прикрепляться к TCP.

Для предотвращения неспецифической адгезии планшеты обрабатывали 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) перед посевом клеток, который связывается с TCP и блокирует адгезию клеток. В качестве модельной клеточной линии использовались эндотелиальные клетки из пупочной вены человека (HUVEC от human umbilical vein endothelial cells), модифицированные для стабильной экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) для простоты визуализации.

В ходе визуализации было получено полное изображение образовавшихся узоров, площадь которого составила примерно 18 см2. Важно и то, что локализация клеток в областях с узором сохранялась в течение одной недели, при этом клетки оставались жизнеспособными, а миграции клеток из узорчатой области не наблюдалось (2a и 2b).

s3.pngИзображение №2

В качестве контрольной группы выступали частицы коллагена I, распыленного без применения акустического поля. Как и ожидалось, в результате эти частицы покрывали поверхность полностью (т.е. без образования узора).

Следовательно, способность манипулировать частицами посредством акустического поля позволяет быстро (< 30 с) и неоднократно структурировать клетки молекулы на площади поверхности сантиметрового масштаба, сохраняя при этом области, которые содержат от нескольких (центральный пучок) до сотен клеток (2b).


Последовательная активация пар преобразователей позволяет генерировать более сложные узоры с множеством взаимодействующих с клетками материалов, что дает возможность потенциально имитировать мириады белков и взаимодействующих с клетками соединений, присутствующих в органическом внеклеточном матриксе.

Дополнительно в ходе испытаний была проверена работоспособность метода формирования клеточного паттерна с помощью сонолитографии. Использовать небулайзер удобно в случае распыления обычных частиц, так как площадь распыления будет большая. В работе с живыми клетками использовать этот аппарат не получится, так как он серьезно повлияет на их жизнеспособность. Соответственно, для распределения жизнеспособных клеток использовался генератор DOD с соплом 80 мкм (2c). Такой метод позволяет генерировать отдельные капли разного размера в зависимости от положения сопла и состава субстрата.

Одновременное использование генератора DOD и акустической системы привело к тому, что отдельные капли сливались. Потому узоры, полученные с помощью небулайзера, имели гораздо более высокое разрешение, чем узоры, полученные генератором DOD.

Ученые отмечают, что одной из основных проблем, возникающих при работе с живыми клетками, является их дегидратация и последующая гибель, так как клетки формируются в воздухе с небольшим объемом жидкости (< 0.3 нл на каплю). При этом клетки должны прикрепиться к субстрату до введения культуральной среды, чтобы предотвратить нарушение узора. Чтобы ускорить адгезии клеток, чашки Петри были покрыты коллагеном типа I, который обеспечивал гидрофильность поверхности. За счет этого попавшие на поверхность капли растекались, будучи смоченными жидким слоем. При этом акустическое воздействие способно деформировать этот жидкий слой, а потому клетки прикреплялись к участкам, соответствующим деформированному слою жидкости. Это указывает на вторичный режим непрямого формирования узора с помощью сонолитографии (2d).

s4.pngИзображение №3

Сонолитография широко применяется для обработки многих узорчатых материалов и подложек. На изображениях выше показаны узоры, состоящие из распыленных частиц чернил на углеродной основе, жидкости от маркера и раствора сахарозы, а также из твердых частиц и порошков (пенополистирол, песок). Любопытно, что между более крупными и мелкими наблюдалось разделение по размеру (3f). В качестве основы для распыления были использованы самые разные материалы: пластмасса (полистирол для культур тканей, полиметилметакрилат и поликарбонат), стекло, бумага, парафильм (Parafilm — влагостойкий термопластик) и пленка из альгината кальция.

Данные примеры являются подтверждением того, что методика сонолитографии обладает широким спектром потенциального применения. Кроме того, к преимуществам сонолитографии стоит отнести и ее быстроту, надежность, гибкость и простоту.

Создание одного узора занимает до 30 секунд, при этом его можно создавать используя как одну настройку массива пар преобразователей, так и менять ее в ходе работы. Другими словами, для создания разных узоров не нужно использовать разные устройства, достаточно просто активировать необходимые пары преобразователей. К примеру, используемая в данном труде восьмиугольная конфигурация может генерировать 15 различных конфигураций акустического поля, по крайней мере, с одной активной парой. Если же рассматривать возможности пространственного разделения по размеру частиц количество потенциальных рисунков увеличивается до 45. А модуляция фаз пар преобразователей позволяет преобразовывать узоры по X и Y без физического перемещения этого узора.

s5.pngПример узоров, полученных при активации разного числа пар преобразователей.

В ходе практических испытаний установка работала с частотой 40 кГц. Это позволило получить элементы размером порядка 100 мкм на большой площади поверхности, что позволяет работать в разных масштабах. Кроме того, используя различные преобразователи частоты, можно дополнительно настроить длину волны и размер элемента. Например, длина волны преобразователя частоты 25 кГц составляет примерно 13.7 мм. Увеличение частоты до 400 кГц генерирует длины волн порядка сотен микрометров, приближаясь к масштабам МГц-овых систем на водной основе.

Для более подробного ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В данном труде была продемонстрирована сонолитография — метод, позволяющий создавать желаемые узоры из частиц разного происхождения, в том числе и из жизнеспособных клеток.

Учитывая бесконтактность данного метода, создание шаблонов из частиц более не зависит от свойств подложки, на которой происходит формирование узора, или от свойств самих частиц. За счет этих свойств метод сонолитографии может быть использован в самых разных направлениях. В ходе опытов, к примеру, была продемонстрирована успешная пространственно локализованная клеточная адгезия. Другими словами, данная методика отлично подходит для работы с живыми клетками, поскольку не нарушает их жизнеспособность, чего нельзя было сказать про более классические методы (например, в случаях использования лазерного излучения).

Не менее важен и тот факт, что процесс сонолитографического создания узоров происходит очень быстро, а для его проведения не нужны особые знания в области акустики или же специфическое и дорогостоящее оборудование.

Манипуляции с частицами с помощью сонолитографии могут быть использованы для создания трехмерных объектов со сложной внутренней архитектурой, в том числе и для создания электроники, где роль частиц будут играть проводящие чернила. Но самым интересным применением, конечно же, остается биомедицина, в частности доставка лекарственных веществ точно по адресу или ускорения процесса заживления тканей.

Для большинства отраслей, от медицины до металлургии, одним из важнейших аспектов успешной работы является контроль. Возможность контролировать свойства и характеристики не только системы в целом, но и каждой составной части, позволяет открыть ее новые функции или же усовершенствовать имеющиеся. Сонолитография, как показало данное исследование, является воплощением контроля.

0 0 голоса
Рейтинг статьи

Подписаться
Уведомить о
guest
0 комментариев
Межтекстовые Отзывы
Посмотреть все комментарии
0
Оставьте комментарий! Напишите, что думаете по поводу статьи.x
()
x